4.緩沖液洗5min/2次。
5.滴加UltraVBlock，在室溫下孵育5分鐘以封閉非特異性的背景染色。
(注：孵育不要超過10分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有5-10%正常羊血清，這一步可以省略。)
6.緩沖液洗5min/2次。
7.滴加一抗工作液37℃孵育1-2小時。(具體孵育時間和溫度由試驗者終決定)。
8.緩沖液洗5min/2次。
9.滴加PrimaryAntibodyEnhancer(增強子)，在室溫下孵育20分鐘。
10.緩沖液洗5min/2次。
11.滴加HRPPolymer(酶標二抗)，在室溫下孵育30分鐘。
(注：HRPPolymer對光敏感，應避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。)
12.緩沖液洗5min/2次。
13.向1mlDABPlusSubstrate(或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen(或AECPlusChromogen)，混勻后滴加到切片上，孵育3-15分鐘。(具體時間由染色深淺決定。)
14.自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。
免疫組化注意事項
1.正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2.在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：
(1)固相載體的選擇
許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
(2)包被抗體(或抗原)的選擇
將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對于多數(shù)蛋白質來說通常為1～10μg/ml。
(3)酶標記抗體工作濃度的選擇
首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。
(4)酶的底物及供氫體的選擇
對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
結語：以上就是小編為大家介紹的有關于免疫組化的原理以及免疫組化的一些作用。相信大家看完之后對此也是有所了解了，也知道免疫組化有哪些注意事項了。因此，在進行免疫組化的時候，則需要注意這些事項哦。
